Den Hirschsprungske Samling indeholder omkring 600 malerier fra 1800-tallet og begyndelsen af 1900-tallet. Guldalderen, skagensmalerne, de fynske malere og de danske symbolister er repræsenterede.

På museet finds nogle af dansk kunsts hovedværker:

• C.W. Eckersbergs Kvinde foran et spejl (1841)
• Christian Købkes portræt af landskabsmaleren Frederik Sødring (1832)
• P.S. Krøyers Sommeraften ved Skagens strand (1899)

L.A. Ring, Michael og Anna Ancher, Kristian Zahrtmann, Christian Købke, P.S. Krøyer og Vilhelm Hammershøi er nogle af museets bedst kendte kunstnere.

Tæt side om side hænger de mange berømte værker i de små, hyggelige rum med lavt til loftet og diskrete farver på væggene. Den nærmest hjemlige hygge understreges af de mange "kunstnermøbler", der står i museets i alt 21 rum. Det er møbler, der er designet af kunstnere: malertaburetter, ammestole, sofaer ... Atmosfæren tilføjer den tunge guldalder en lethed og varme, som man ikke møder på mere pompøse museer som f.eks. Statens Museum for Kunst overfor.

Samlingen blev skabt af den kunstinteresserede tobaksfabrikant Heinrich Hirschsprung (1836-1908), der i 1902 besluttede at forære sin gigantiske samling af dansk kunst til staten ... dog på den betingelse, at der blev bygget et særligt museum med en intim atmosfære. Hans tids hang til store, pompøse, græsk inspirerede bygningsværker brød han sig ikke om.

Heinrich Hirschsprung nåede aldrig at se museet i Stockholmsgade andet som en arkitekttegning. Han døde i 1908, og museet stod først færdigt 1911, men i forhallen til museet hænger P.S. Krøyers portræt af den københavnske tobaksfabrikant, og mosaikken på gulvet fortæller også, hvorfra pengene til de mange malerier kom fra: Mosaikken forestiller tobaksplanter.